正交实验法优化菊粉外切酶水解菊粉的工艺研究（一）

菊粉（Inulin）又称菊糖是正交由D-呋喃果糖分子以β-（1，2）糖苷键连接而成的实验水解多聚果糖，在每个菊粉分子的法优粉外末端连接有一个葡萄糖残基，呈直链结构，化菊聚合度一般为30左右。切酶菊粉广泛存在于菊苣和菊芋中。菊粉究其中菊芋在我国广泛种植，艺研产量高，正交环境适应性强，实验水解种植成本低，法优粉外是化菊一种开发利用前景广阔的作物。菊粉水解产生的切酶高果糖浆相比于其它方式具有更高的果糖含量。

菊粉酶（Inulinase）是菊粉究能水解β-2，1-D果聚糖果糖苷键一类酶，艺研系统名为β-2，正交1-D果聚糖酶，属糖基水解酶32家族（Glycosylhydrolasesfamily32），菊粉水解酶主要来源于菊科植物组织和部分微生物。菊粉酶可以催化菊粉水解为果糖或低聚果糖。菊粉酶按照作用方式不同分为外切型菊粉酶和内切型菊粉酶，外切型菊粉酶作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，主要产物为果糖；内切型菊粉酶随机地断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要为低聚果糖。

果糖作为一种单糖存在于许多水果和蔬菜中如葡萄干、苹果、葡萄、生胡萝卜、洋葱等。在自然界中，它也作为蔗糖、棉子糖、菊粉和水苏糖的形成单元存在。果糖的甜度是蔗糖的1.5～2倍。它在人体中起到一系列的生理作用包括绕过葡萄糖代谢途径，降低血糖指数，提高铁吸收，加速乙醇代谢，防止肥胖和动脉粥样硬化等。传统上生产高果糖浆的方法是将淀粉水解后产生的葡萄糖异构化。但是淀粉在处理之前要先进行凝胶化，并且该过程需要大量的能量。同时，葡萄糖异构化生产果糖的工艺受到较强的热力学限制：葡萄糖和果糖的平衡浓度约为50%。本文采用酶水解法对高果糖浆制备工艺进行研究，在单因素实验的基础上结合正交试验进行研究，得出最优的反应条件，为工业生产高果糖浆提供理论依据和参考。

一、方法与步骤

1、材料与仪器

（1）仪器与设备UV-2800紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州普天仪器有限公司；ALB-124电子天平，赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；JJ-1增力电动搅拌器，上海梅香仪器有限公司；SHK-IIIS循环水式多用真空泵，郑州科泰实验设备有限

（2）原料与试剂

菊粉由西安昌岳生物科技有限公司提供，菊粉外切酶由郑州百利化工产品有限公司提供，氢氧化钠：天津恒兴化学试剂制造有限公司；亚硫酸钠，结晶苯酚：天津市北联精细化学品开发有限公司；酒石酸钾钠：天津市瑞金特化学品有限公司；3-5二硝基水杨酸，D-果糖：上海展云化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

2、实验方法

（1）酶解实验

称取定量菊粉溶于蒸馏水定容至100mL，使用醋酸缓冲液调节其pH，每12h测量一次还原糖含量。以还原糖得率为指标，研究温度、底物浓度、pH、加酶量对菊粉酶解的影响。

（2）酶活测定

菊粉酶活力的测定参照Vincenza等人的方法在下列确定的条件下测量酶活性：温度60°C，pH=5，反应时间为20min。酶活性的定义为在上述标准条件下每分钟转化lμmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位，用U表示。

（3）还原糖检测方法

取过滤后酶解液1mL定容至100mL，取2mL加入3mLDNS试剂，沸水加热5min，流水冷却至室温后在加入5mL蒸馏水至10mL于540nm下检测吸光度。以果糖为标准品绘制曲线。回归方程为：y=0.05585x+0.00529，相关系数R²为0.991，还原糖浓度曲线的回归性较好，可以进行定量

（4）还原糖得率计算

经检测菊粉原料中还原糖含量为3%。还原糖得率的计算公式如下，其中Y为得率，m为酶解液中总还原糖质量，m为原料中还原糖质量，M为原料总质量。

3、试验设计

（1）单因素试验

在底物浓度为30g/L，pH为7和加酶量为40U/g的条件下，考察温度对菊粉酶解液中还原糖得率的影响；在温度为55⁰C，pH为7和加酶量为40U/g的条件下，考察底物浓度对菊粉酶解液中还原糖得率的影响；在温度为550C，底物浓度为30g/L和加酶量为40U/g的条件下，考察pH对菊粉酶解液中还原糖得率的影响；在温度为55⁰C，pH为7和底物浓度为30g/L的条件下，考察加酶量对菊粉酶解液中还原糖得率的影响。

（2）正交实验设计

通过单因素试验的结果发现在反应60h以后还原糖得率的增速变缓，综合经济因素选定60h作为正交试验的反应时间。在单一素试验的基础上，以温度、pH、底物浓度和加酶量进行正交试验。因素及水平见表1。

二、结果分析

1、单因素试验结果

（1）温度

温度对菊粉酶解液还原糖得率的影响，见图1。在较低温度范围内，酶活随温度的升高而增大，55⁰C时菊糖酶解效果达到最好。当温度继续升高时酶解效果降低，在60⁰C时效果骤降推断是由于温度升高导致酶活性降低所致。因此选择55⁰C、50⁰C、45⁰C进行优化试验。
 

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