血清药物化学结合网络药理学探讨养心氏片治疗冠心病的物质基础与 作用机制（一）

目的血清学探心氏心病探讨养心氏片治疗冠心病的药效物质基础与潜在的作用机制。方法采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术对养心氏片(Yangxinshitablet，药物药理用机YXST)的化学入血成分进行分析；利用STITCH、TCMSP、结合BindingDB数据库预测YXST入血成分的网络靶点；采用TTD、DrugBank、讨养PharmGKB、片治MalaCards、疗冠CTD数据库收集冠心病相关靶点；通过STRING数据库对得到的质基制成分靶点和疾病靶点构建蛋白相互作用关系(protein-proteininteraction，PPI)网络从而筛选YXST治疗冠心病的础作潜在靶点；利用R软件的clusterProfiler包对潜在靶点进行基因本体论(geneontology，GO)功能注释和京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，血清学探心氏心病KEGG)通路分析；采用Cytoscape软件构建“入血成分-潜在靶点”网络并分析关键化合物和关键靶点。药物药理用机

结果通过对大鼠口服灌胃给予YXST提取液后的化学血浆进行分析，共检测到26个原型成分。结合在数据库中收集得到入血成分对应的网络287个靶点和冠心病相关的199个靶点。通过交集分析和PPI网络的构建共获得70个YXST治疗冠心病的潜在靶点。对潜在靶点进行GO功能注释和KEGG通路分析发现，YXST治疗冠心病主要涉及了炎症反应、氧化应激以及晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(advancedglycationendproducts-receptorforadvancedglycationendproducts，AGE-RAGE)、动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor，TNF)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、C型凝集素受体、Th17细胞分化、Toll样受体等信号通路。通过构建“入血成分-潜在靶点”网络分析得到3个关键化合物和16个关键靶点。结论YXST可通过调节TNF、PTGS2、NOS2、NOS3等关键靶点干预炎症反应、氧化应激、动脉粥样硬化等过程发挥治疗冠心病的作用，其潜在的有效成分为大豆苷、小檗碱和葛根素。本研究充分体现了YXST通过多成分-多靶点-多途径治疗冠心病的作用特点，为深入研究YXST的药理作用机制提供重要参考。

冠心病是临床上常见的一种心血管疾病，主要发生于中老年人群。近年来，随着人们饮食结构和生活习惯的变化，该病的发病率和死亡率逐年上升，并呈现年轻化趋势，严重威胁人类健康。冠心病主要是由冠状动脉结构或功能异常，使血管狭窄、痉挛或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏疾病。中医理论认为，冠心病属“胸痹”“心痛”范畴，因痰浊阻滞，瘀血气滞，累及于心，导致心脉不畅，血脉痹阻，故治疗原则上应以活血化瘀为法。

养心氏片(Yangxinshitablet，YXST)是由黄芪、党参、丹参、葛根、淫羊藿、山楂、地黄、当归、黄连、延胡索、灵芝、人参和甘草共13味药材制成的一种中药复方制剂，具有益气活血、化瘀止痛之功效，在临床上常用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等心血管疾病。现代药理学研究表明，YXST具有抗血小板聚集、降低血黏度、抑制血栓形成、降低心肌耗氧量、改善心肌缺血，增强心功能等作用。目前，对YXST的研究多集中于临床或是在动物模型上对某些因子的考察，缺乏对其药效物质基础和作用机制的深入研究。

网络药理学融合了系统生物学、多向药理学等理论，通过对“药物-靶点-疾病”之间复杂互作关系网络的分析，多层次地阐明药物治疗疾病的作用机理。网络药理学具有整体、系统的分析特点，已经被广泛应用于中药领域各方面的研究。此外，血清药物化学认为，给药后血液中含有的成分才是中药复方在体内直接发挥药效作用的物质。因此，本研究首先采用HPLC-ESIQ-TOF-MS/MS技术对YXST的入血成分进行分析。在此基础上，结合网络药理学技术分析YXST入血成分的作用靶点，探讨YXST治疗冠心病可能的物质基础和作用机制。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪，配置在线脱气机、四元泵、柱温箱、自动进样器和紫外检测器均购自美国Waters科技有限公司；TripleTOF5600plus质谱仪(美国ABSCIEX公司)；XS105DU十万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；H1650-W型高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

YXST(规格：0.6g×36片/盒；批号：151102)由青岛国风药业股份有限公司提供。木兰花碱(批号：MUST-15110910)、葛根素(批号：MUST-13111203)、甘草苷(批号：MUST-16032801)、黄连碱(批号：MUST-15011004)、表小檗碱(批号：MUST-15022101)、大豆苷(批号：MUST-12102710)、非洲防己碱(批号：MUST-13101201)、盐酸药根碱(批号：MUST-15112011)、盐酸小檗碱(批号：MUST-12122110)、巴马汀(批号：MUST-12022707)、脱氢紫堇碱(批号：MUST-12051002)、丹酚酸B(批号：MUST-13103113)和灵芝酸A(批号：MUST-16051010)对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均>98%。甲醇(色谱纯，批号：20141016)购自百灵威科技有限公司；甲酸(色谱纯，批号：k1612047)购自阿拉丁试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2动物

6只SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。动物使用许可证号：SYXK(浙)2012-0178。适应性饲养1周，自由进食饮水，保持12h光照/黑暗，温度为(20±2)℃，相对湿度控制在(50±10)%。所有动物实验操作遵守浙江大学实验动物道德伦理委员会有关规定。

1.3样品制备

1.3.1YXST提取液的制备

取YXST，除去包衣，研细。称取20g粉末，用500mL70%甲醇超声处理60min，抽滤，将提取液浓缩至每1mL含生药粉末1g。

1.3.2大鼠血浆样品的制备

大鼠受试前12h禁食不禁水，口服灌胃给予YXST提取液14g·kg–1。给药前和给药后1h从尾静脉取血0.5mL，4000r.min-1离心5min，分离血浆，于–20℃下保存。分析前，取血浆样品200μL，加入5倍量甲醇，涡旋30s后静置10min，13000r.min-1离心10min。取上清液在常温下氮气吹干，残渣用200μL70%甲醇复溶，13000r.min-1离心10min，取上清供HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析。

1.4色谱与质谱条件

HPLC分离采用WatersUPLCsystem，色谱柱为WatersCORTECSC18+(4.6mm×150mm,2.7μm)。流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)，梯度洗脱：0~20min，5%→25%B；20~40min，25%→41%B；40~60min，41%→81%B；60~65min，81%→96%B；65~70min，96%B。分析时间70min，后运行10min，进样量10μL，流速0.5mL·min–1，柱温35℃。

质谱分析采用TripleTOF5600plus质谱仪，对ESI正(+)负(–)离子同时进行扫描，参数设置如下：喷雾电压：+5.5kV(+)和−4.5kV(–)；离子源温度：600℃(+)和550℃(–)；Gas1：空气，50psi；Gas2：空气，50psi；CUR：氮气，30psi；碰撞电压：(40±20)V；扫描范围：TOF-MS为m/z100~2000，TOF-MS/MS为m/z50~2000。实验数据利用Peakview软件(ABSCIEX,version1.2.0.3)进行处理。

1.5网络药理学分析

1.5.1YXST入血成分靶点的收集

基于上述鉴别得到的YXST入血成分，用化合物名称或结构式(SMILES格式表示)为；

关键词在STITCH(SearchToolforInteractionsofChemicalsandProteinsDatabase,http://stitch.embl.de/)；

TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；

BindingDB(https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp)；

数据库中进行检索，得到每个入血成分的靶点。

再通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点名归整成标准基因名(Officialsymbol)，限定物种为“Homosapiens”。

1.5.2冠心病相关靶点的收集

以“coronaryheartdisease”“coronarydisease”为关键词：

通过TTD(TherapeuticTargetDatabase,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；

DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)；

MalaCards(https://www.malacards.org/)；

CTD(ComparativeToxicogenomicsDatabase,http://ctdbase.org/)

数据库进行检索，获取冠心病相关的靶点，并按“1.5.1”项下方法进行标准化。

1.5.3YXST治疗冠心病潜在靶点的筛选

取入血成分靶点与疾病靶点的交集，即得YXST治疗冠心病的直接作用靶点。此外，将成分靶点和疾病靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)进行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)分析，限定物种为“Homosapiens”，根据置信度分值选择confidencescore≥0.7的数据，并使用Cytoscape软件(version3.6.0)进行可视化，进一步筛选与疾病靶点存在间接作用关系的成分靶点。将直接和间接作用靶点合并即得YXST治疗冠心病的潜在靶点。

1.5.4功能注释及通路分析

基于上述所得的YXST治疗冠心病的潜在靶点，利用R语言(version3.4.1)的clusterProfiler包进行基因本体论(geneontology，GO)功能注释和京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路分析，探索YXST治疗冠心病的分子作用机制。

1.5.5网络的构建及分析

将得到的入血成分和对应的潜在靶点导入Cytoscape软件构建“入血成分-潜在靶点”网络图，再利用NetworkAnalyzer插件对网络进行拓扑性质分析，包括节点度(degree)、介数中心度(betweennesscentrality)和紧密中心度(closenesscentrality)。依据3项数值均在平均值以上的标准筛选YXST治疗冠心病的关键化合物和关键靶点。

声明：本文所用图片、文字来源《中国现代应用药学》2020年8月，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系
 

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