真菌毒素的检验（三）

5、真菌结果计算

按下式计算样品中每种黄曲霉毒素的毒素的检浓度：

式中：c——试样中每种黄曲霉毒素的浓度，μg/kg；

A——试样按外标法在标准曲线中对应的真菌浓度，μg/L；

V——试样提取过程中提取液的毒素的检体积，mL；

m——试样的真菌取样量，g；

f——试样溶液衍生后较衍生前的毒素的检浓缩倍数。

计算结果表示到三位有效数字。真菌

当黄曲霉毒素B₁、毒素的检黄曲霉毒素B₂、真菌黄曲霉毒素G₁、毒素的检黄曲霉毒素G₂的真菌含量分别为25.0μg/L、6.25μg/L、毒素的检25.0μg/L、真菌6.25μg/L时，毒素的检产生的真菌色谱图见图1。

出峰顺序为黄曲霉素G₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素G₂、黄曲霉毒素B_2。

二、赫曲霉毒素的检验

赭曲霉毒素A是一种强力的肝脏毒素和肾脏毒素并有导致畸形、导致突变和致癌作用。为此，国际癌症研究机构IARC其定为ⅡB类致癌物。食品法典委员会(CAC)对小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品中赭曲霉毒素A限量为≤5.0μg/kg。

欧盟委员会(EU)对原粮中赭曲霉毒素A的限量沿用了CAC的限量规定，对谷物产品中的赭曲霉毒素A则进一步严格限量至≤3.0μg/kg。2005年1月1日对于上述法规中增加了限量标准：葡萄酒、其他用于饮料制作的葡萄酒和/或葡萄，2.0μg/kg；葡萄汁和其他饮料中的葡萄汁成分，2.0μg/ kg。

中国国家标准GB 2715-2005《粮食卫生标准》对豆类中的赭曲霉毒素A限量为≤ 5.0μg/ kg。

1、原理

试样中加入提取溶液后高速均质提取并过滤、稀释后，滤液经过含有赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和柱色谱净化，淋洗除杂，以洗脱溶液洗脱，洗脱液分别供荧光光度计或带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定(以外标法定量)。

2、试剂和材料

除非另有规定，试剂为分析纯，水为重蒸馏水、去离子水或与之相当的纯水。

①甲醇：色谱纯。

②碳酸氢钠。

③聚乙二醇(PEG8000)。

④氯化钠。

⑤提取溶液：甲醇+水(80:20)；10g/L聚乙二醇+50g/L碳酸氢钠溶液，pH 8.310g/L碳酸氢钠溶液。

⑥吐温20(Tween-20)。

⑦淋洗溶液：

a．淋洗缓冲液：称取25g氯化钠、5g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1mL Tween-20，用水稀释至1L。

b．25g/L氯化钠+5g/L碳酸氢钠溶液：pH 8.1。

c．磷酸盐缓冲溶液(PBS)/0.1％T’ween-20淋洗缓冲液：在1000mL PBS溶液中加入1.0mL Tween-2Q。

⑧磷酸钠。

④ 六烷基三甲基溴酸铵(C-tab)。

⑤ 曲霉毒素A标准品：纯度≥99％。

⑪赭曲霉毒素A标准储备溶液：用甲醇配制0.100mg/mL的赭曲霉毒素A标准储备液，保存于4℃冰箱备用。

⑫赭曲霉毒素A标准工作溶液：准确移取适量的赭曲霉毒素A标准储备液。

⑬乙腈，色谱纯。

⑭0.1mol/L氢氧化钠。

⑮浓硫酸。

⑯0.05mol/L硫酸溶液。

⑰硫酸奎宁(C₂₀H₂₄N₂0₂·H₂S0₄·2H₂0)。

⑱荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液的荧光光度计读数相当于36。

3、仪器和设备

①高效液相色谱仪：配置荧光检测器。

②荧光光度计。

③粉碎机。

④水平方向振荡器。

⑤高速均质器：18000～22000r/min。

⑥槽纹折叠滤纸。

⑦玻璃纤维滤纸。

⑧台式离心机。

⑨玻璃注射器：10mL。

⑩空气压力泵。

⑩玻璃试管。

⑩微量注射器：100gL。

⑩赭曲霉毒素A免疫亲和柱。

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