蒙药砂蓝刺头定性与定量质量控制方法研究（二）

2.3.2 色谱条件

以Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,蒙药5μm）为色谱柱；乙腈（A)-0.1%甲酸（B）为流动相梯度洗脱（0～7 min,5%A;7～35 min,5%～28%A;35～53 min,28%～90%A;53～65min,90%A）；体积流量1.0 m L/min；柱温30℃；检测波长为275 nm；进样量为10μL。

2.3.3 精密度试验

称取样品粉末0.25 g(S5），砂蓝按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，定性定量按“2.3.2”项下色谱条件连续进样6次，质量以MMQ(S）峰为参照峰，控制计算色谱图中特征峰相对保留时间和相对峰面积，研究结果显示RSD分别为0.05%～0.49%和0.39%～2.15%。蒙药

2.3.4 稳定性试验

取同批次砂蓝刺头粉末（S5)1份，砂蓝按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，定性定量按“2.3.2”项下色谱条件分别于0、质量1、控制2、研究4、蒙药6、砂蓝12、定性定量24 h进样，以MMQ峰为参照峰，记录和计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积。结果显示RSD分别为0.06%～0.54%和0.33%～1.89%。

2.3.5 重复性试验

取同一批次砂蓝刺头粉末（S5)6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件进样，以MMQ为参照峰，记录和计算各共有峰保留时间、相对峰面积，计算其RSD分别为0.07%～1.11%和0.32%～3.19%。

2.3.6指纹图谱的建立与分析

按“2.3.1”项和“2.3.2”项对样品进行制备和测定，记录色谱图。运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004版）”，导入S1～S9号样品HPLC数据，以S1为参照图谱，选择平均数法进行自动峰匹配，生成EGT对照指纹图谱（图2-A）。以EGT对照指纹图谱为参照图谱，同时导入7批（S10～S16）蓝刺头属其他种样品HPLC图谱数据，选择平均数法进行自动峰匹配，得到蓝刺头属其他种图谱（图2-B）并计算相似度。

计算得到S1～S9号样品相似度分别为0.970、0.950、0.922、0.989、0.959、0.978、0.980、0.916、0.697，伪品相似度分别为0.849、0.452、0.806、0.327、0.499、0.580、0.832。除批号为20120815样品外，其余EGT样品相似度均在0.9以上，种内相似度较高，而蓝刺头属其他种植物样品相似度均低于0.9。

将S1～S9号样品与蓝刺头属其他种样品的指纹图谱进行比较，并结合各色谱峰的峰形、峰高以及分离情况等信息，标定了8个特征峰，并经对照品指认4个峰，分别为2号峰是水杨酸、4号峰是绿原酸、5号峰是MMQ、6号峰是异绿原酸，其中MMQ是本研究发现的含量较高的专属性成分，其色谱峰的对称性好、峰较高，与相邻色谱峰达到基线分离，故选定MMQ为参照峰（S）。并计算得到各特征峰相对保留时间的RSD均小于3%，表明特征峰的出峰时间较为稳定，但其相对峰面积的RSD相差较大，表明不同批次中各成分含量存在一定的差异。将16批样品指纹数据进行初步数据筛选，筛选出峰面积比>2%的指纹数据，结果导入SIMCA 13.0软件，进行最小二乘法判别分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA）与聚类分析（hierarchical cluster analysis,HCA），结果见图3和图4。从OPLS-DA和HCA结果显示，EGT与蓝刺头属其他种样品分成2大类，说明所建立的EGT特征指纹图谱有一定的鉴别作用，可用于EGT的质量评价。

VIP结果显示13号峰（MMQ）为最主要的贡献成分，该成分为EGT的专属性成分，可作为EGT含量测定的指标成分。

2.4 MMQ的定量测定

2.4.1 色谱条件

采用Diamonsil Plus C18(250mm×4.6 mm,5μm）色谱柱；乙腈-0.1%甲酸水溶液（14∶86）为流动相，体积流量为1.0 m L/min，柱温30℃，检测波长为230 nm，进样量为10μL。理论板数按MMQ峰计不低于2500。对照品溶液和供试品溶液的HPLC见图5。

2.4.2 供试品溶液的制备

取EGT样品（过3号筛）0.25 g，精密称定，置100 m L具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 m L，称定质量，超声（功率250 W、频率40 k Hz）处理30 min，放冷，用70%甲醇补充减失质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.3对照品溶液的制备

精密称取MMQ对照品10.12 mg，置于10 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含1.012 mg/m L MMQ的溶液，作为对照品贮备溶液。

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