参柏洗剂质量标准提高研究（二）

3苦参中苦参碱和氧化苦参碱含量测定

3.1色谱条件

3.1.1流动相的参柏考察

曾参考《中国药典》2015年版一部第202页苦参项下收载的苦参碱和氧化苦参碱含量测定色谱条件，以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10）为流动相，洗剂流速为每分钟1 mL，质量柱温设置为35 ℃，标准检测波长λ=220 nm，提高结果供试品色谱中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰分离度差或是研究存在峰形不好的现象，经摸索，参柏对流动相比例进行调整，洗剂调整为以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（84∶7∶9）为流动相，质量柱温设置为40 ℃，标准其他色谱条件不变，提高供试品中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰能达到基线分离，研究且阴性对照无干扰，参柏

3.1.2流动相流速的洗剂考察

分别考察了流动相流速为每分钟0.8 mL、1.0 mL、质量1.2 mL苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离效果，结果在三种不同流速情况下均可达到基线分离，综合考虑分析时间、分离度、色谱峰峰形、仪器分析压力等因素，本实验确定流速为每分钟1 mL 。

3.1.3柱温的考察

分别考察了柱温设置为30 ℃、35 ℃、40 ℃时，苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离情况，结果三个不同柱温条件下均可达到分离，综合考虑分离度、分析时间、峰形等因素，本实验确定柱温为40 ℃。

3.1.4色谱柱的考察

分别考察了菲罗门Luna NH2柱、Waters Xbridge BEH Amide色谱柱、Agilent Zorbax NH2柱(规格：4.6 mm×250 mm，粒径：5 µm)]色谱峰分离效果，结果前两根色谱柱存在分离度或峰形差的现象，本实验最终采用了Agilent Zorbax NH2柱。

3.1.5色谱条件的确定

以氨基键合硅胶为填充剂[ Agilent Zorbax NH2柱 (规格：4.6 mm×250 mm，粒径：5 µm)]，配制乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液体积比为（84∶7∶9）的溶液作为流动相，流速为每分钟1.0 mL；柱温为40 ℃；检测波长λ=220 nm。

3.2苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液的配制

①精密称取苦参碱（110805-200306）10.90 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.09 mg的对照品储备液。

②精密称取氧化苦参碱（110780-201007，以92.3%计）12.06 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.4452 mg的对照品储备液。

3.3供试液的制备

分别考察了样品是否离心、加浓氨试液摇匀后是否静置、以及三氯甲烷提取次数（3次、4次、5次）对苦参碱和氧化苦参碱提取效果的影响，综合考虑苦参碱和氧化苦参碱含量及提取操作过程中乳化现象情况，最终确定供试液的制备方法如下：

精密量取参柏洗剂离心（3000 r/min，5min）后的上清液10 mL，置分液漏斗中，加入浓氨试液0.5 mL，摇匀，加三氯甲烷振摇提取4次，20 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。

3.4分析方法验证

3.4.1专属性考察

取苦参阴性对照样品，照供试液制备的方法制得阴性对照溶液。分别精密吸取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液、参柏洗剂供试品溶液、苦参阴性对照溶液各5 µL，按“3.1.5”项下色谱条件测定。结果苦参阴性液相色谱图在与对照品和供试品液相色谱图相同保留时间位置上无色谱峰出现，说明该含量测定方法专属性较好，见图4。

3.4.2线性考察

①分别精密吸取苦参碱对照品储备液（1.09 mg/mL）0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，放置2 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.109 mg/mL、0.218 mg/mL、0.436 mg/mL、0.654 mg/mL、0.872 mg/mL、1.09 mg/mL的苦参碱对照品溶液，分别进样5 μL，按“3.1.5”项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样苦参碱量X为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99988），表明苦参碱进样量在0.545 μg～5.45 μg范围内与峰面积线性关系良好。

②分别精密吸取氧化苦参碱对照品储备液（0.4452 mg/mL）0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，放置5 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.04452 mg/mL、0.08904 mg/mL、0.17808 mg/mL、0.26712 mg/mL、0.35616 mg/mL、0.4452 mg/mL的氧化苦参碱对照品溶液，分别进样5 μL，按“3.1.5”项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样氧化苦参碱量X为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99993），表明氧化苦参碱进样量在0.2226 μg～2.226 μg范围内与峰面积线性关系良好。

3.4.3精密度考察

精密吸取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液5 μL，连续进样6次，按照“3.1.5”项下色谱条件测定。计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.18%（n=6），氧化苦参碱色谱峰面积RSD值为0.99% (n=6)，表明所用仪器设备精密度较好。

3.4.4稳定性考察

取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、21 h、24 h小时进样5 μL，按照“3.1.5”项下色谱条件测定。计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.50% （n=8），氧化苦参碱色谱峰面积RSD为1.08%（n=8），表明该含量测定供试品溶液在24h内稳定性良好。

3.4.5重复性试验

按拟定的含量测定方法，对同一批参柏洗剂(批号：20200501)分别制备6份供试液，按照“3.1.5”项下色谱条件测定含量，结果苦参碱平均含量为0.2330 mg/mL，RSD为1.92%（n=6），氧化苦参碱平均含量为0.0448 mg/mL，RSD为1.43%（n=6），苦参碱和氧化苦参碱总和平均含量为0.2778 mg/mL，RSD为1.82%（n=6），表明所建含量测定方法的重复性良好。

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