抑制烟草青枯病的3株放线菌筛选及鉴定（三）

2.4菌株L2-003-A-5的抑制烟草鉴定

2.4.1菌株L2-003-A-5的形态特征

菌株L2-003-A-5在扫描电镜下的形态如图2所示，菌株的青枯气生菌丝明显呈卷曲螺旋状；孢子呈短圆柱形，孢子的株放表面平滑；菌丝生长能力旺盛、分支明显，线菌可见散落的筛选孢子分布。菌株L2-003-A-5在高氏一号琼脂中生长迅速(图3)，抑制烟草其气生菌丝呈白色，青枯基内菌丝呈淡黄色，株放不产生可溶性色素。线菌将菌株L2-003-A-5在8种培养基中培养和观察，筛选结果显示，抑制烟草气生菌丝和基内菌丝以白色偏淡黄为主，青枯无可溶性色素产出，株放在酵母膏-麦芽膏琼脂、线菌马铃薯浸汁琼脂、筛选营养琼脂等3种培养基上的长势较差(表2)。

2.4.2菌株L2-003-A-5的生理生化特征

菌株L2-003-A-5生长的pH范围是6～9，最适pH为7；对NaCl耐受能力较差，只能在含1%NaCl的培养基中生长，且长势较差；生长温度为25～40℃，最适温度为30℃；淀粉水解、纤维素水解、油脂水解、甲基红、牛奶凝固和过氧化氢酶反应呈阳性，明胶液化反应、产H2S、柠檬酸盐反应、硝酸盐还原和苯丙氨酸脱氢酶反应呈阴性。

2.4.3菌株L2-003-A-516SrRNA基因部分序列分析

测序结果显示，菌株L2-003-A-5的16SrRNA基因部分序列长度为1493bp，在GenBank核酸登录号为KT119348。根据系统发育分析，菌株L2-003-A-5属于链霉菌属细菌，与典型菌株Streptomy-cessomaliensisNBRC12916T、Streptomycesalbidofla-vusDSM40455T、氢化链霉菌(Streptomyceshydroge-nans)NBRC13475T、浅紫链霉菌(Streptomycesviola-scens)ISP5183T、StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T聚为一簇，与这些菌株的16SrRNA基因相似性均为99.9%；与典型菌株StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T的16SrRNA基因相似性分别为99.7%和99.4%。通过邻接法构建的基于菌株L2-003-A-5及相关菌株16SrDNA序列的系统发育树如图5所示。综合分析与菌株L2-003-A-5相似性最近的菌株的形态特征、生理生化特征和16SrRNA基因序列比对(Rongetal,2009；魏玉珍等,2010；秦盛等,2009；谭力等,2015；王毓舒,2011；Kye,Yong,1993)，判断L2-003-A-5为一株微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。

2.5菌株SC-168-A-2的鉴定

2.5.1菌株SC-168-A-2的形态特征

菌株SC-168-A-2在扫描电镜下的形态如图2所示，菌株的气生菌丝呈长直孢子链状；孢子呈短圆柱形，四周呈内陷形态；菌丝生长能力旺盛、分支明显。在供试的8种培养基中，SC-168-A-2的气生菌丝以白色为主，基内菌丝以淡黄或白色为主；在营养琼脂培养基上生长状况较差(表2)，在包括高氏一号培养基(图3)在内的培养基中均不产生可溶性色素。

2.5.2菌株SC-168-A-2的生理生化检测

适于菌株SC-168-A-2生长的pH范围是6～9，最适pH为7和8；菌株SC-168-A-2能耐受8%Na‐Cl；生长温度范围为15～45℃，最适温度为30℃；淀粉水解、纤维素水解、油脂水解、牛奶凝固、产H2S反应、过氧化氢酶反应和甲基红反应呈阳性，明胶液化、硝酸盐还原和苯丙氨酸脱氢酶反应呈阴性。

2.5.3菌株SC-168-A-216SrRNA基因部分序列分析

菌株SC-168-A-2的16SrRNA基因部分序列长度为1436bp，在GenBank核酸登录号为KR140205。根据系统发育分析，菌株SC-168-A-2属于链霉菌属，与典型菌株Streptomycespraten-sisch24T系统发育关系最近，16SrRNA基因相似性为99.8%；与另外3个典型菌株Streptomycesgriseopla-nusAS4.1868T、StreptomycescyaneofuscatusJCM4364T和StreptomycesanulatusNRRLB-2000T的16SrRNA基因相似性分别为99.1%、98.5%和98.3%。综合分析形态特征、生理生化特征和16SrRNA基因部分序列(杨桂柳等,2015；Kimetal,2012)，判定菌株SC-168-A-2属于链霉菌属的Streptomycespratensis。通过邻接法构建的基于菌株SC-168-A-2及相关菌株16SrDNA序列的系统发育树如图6所示。

3讨论

本研究筛选了3株对烟草青枯病原菌拮抗效果良好的放线菌，经鉴定均为链霉菌，而目前已见报道的拮抗烟草青枯病原菌的放线菌种类绝大多数也是链霉菌，本研究结果验证了链霉菌在这方面的良好效果。已报道的能拮抗烟草青枯病原菌的链霉菌种类主要包括薰衣草链霉菌(S.lavendulae)(张薇,2009)、橄榄绿链霉菌(S.olivaceoviridis)、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌(S.roseofulvus)(陆铮铮,蒋选利,2015)、娄彻氏链霉菌(S.rochei)(王岩,2009)等，本研究结果丰富了链霉菌拮抗烟草青枯病原菌的种类。另外，已有的研究表明，可用于农业生物防治的放线菌中60%是链霉菌(Tanaka,Omura,1993)，这可能是因为链霉菌是革兰氏阳性细菌放线菌科中最大的属，种类繁多，在各种生活环境中分布广泛，更重要的是链霉菌可以产生大量种类丰富的活性次生代谢产物(Kimetal.,2003；Parketal.,2008；Wangetal.,2007)，这些代谢产物具有多样的功能，可广泛应用于农业生物防治领域。本研究筛选所得的链霉菌种类也有在农业生物领域的报道，如S.microflavus具有促进植株生长(张琪等,2018；郭建军等,2013)、产生抗菌活性(王磊,2011；黄灿等,2007)等特性，S.albidoflavus也有抗菌能力(张雯龙等,2012；周丽娜等,2015；戚珊珊,2011；于素亚等,2012)，但这些微生物在拮抗烟草青枯病原菌的特性方面鲜有报道。另外，目前报道的多数烟草病原菌的拮抗微生物不止对一种病原菌具有抑制作用(易有金,2007；展丽然等,2008；王娜娜,2012)，而此特性是拓宽拮抗微生物应用范围的重要基础。本研究所筛选获得的拮抗放线菌对赤星病菌及辣椒、番茄、马铃薯等茄科类植物青枯病菌均有抑制作用，抑菌范围广，提示各拮抗菌株具有用于研制生物有机肥的潜力，具有进一步开发研究的价值。

4结论

本研究从四川2个烟草种植区的根际土中分离筛选获得3株拮抗烟草青枯病原菌的放线菌；对抑菌谱的测定发现，该3株菌不仅对烟草青枯病原菌具有较好的拮抗效果，对烟草赤星病及辣椒、番茄、马铃薯青枯病的病原菌均有抑制效果。结合表型特征、生理生化特征和遗传特征分析，确定3株放线菌均为链霉菌，分别属于Streptomycesmicroflavus、Streptomycesalbidoflavus和Streptomycespratensi。

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