灵芝发酵粉中三萜化合物提取、纯化及结构初步分析（一）

灵芝是灵芝一种宝贵的药用真菌，其中以赤芝（又名红芝）和紫芝的发酵粉中药理价值最高，被视为珍贵的萜化提中药材。化学成分研究表明多糖和三萜类化合物为主要的合物药效成分，其中灵芝三萜有强烈的纯化药理活性，可以起到抗氧化、及结抗肿瘤、构初调节免疫、步分抑制疼痛、灵芝抑制组织胺释放等作用。发酵粉中

灵芝三萜化合物提取和纯化方法很多，萜化提提取方法有超声波辅助法、合物回流提取法、纯化微波法、及结超临界CO2提取法，构初纯化方法有吸附色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法，其中回流提取法操作简单、提取效率高，适合中小企业生产在线监测。试验所用材料灵芝发酵粉是以谷物为基质经灵芝固态发酵后精制而成，基质中淀粉等物质可能会对产品中三萜化合物的形成及三萜的结构产生影响，进而影响提取工艺，研究结果会为后期功效分析奠定基础。

一、材料与方法

1、材料

灵芝发酵粉：以谷物为基质，经灵芝固态发酵后精制而成，由山西瑞芝生物科技有限公司提供。

2、仪器与试剂

DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海恒科学仪器有限公司；UV754N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL6M低速离心机：上海百典仪器设备有限公司；KQ-300GDV数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FW100微型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；BS-100A自动部份收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；LC1200高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；TENSOR27傅立叶红外光谱仪：德国布鲁克公司；Cary5000紫外-可见-近红外分光光度计：美国安捷伦公司；UV-A紫外分析仪：上海嘉鹏科技有限公司。

齐墩果酸标准品：安徽酷耳生物工程有限公司。200～300目柱层析硅胶：青岛海洋化工厂生产；薄层层析硅胶板：烟台江友硅胶开发有限公司。

3、方法

（1）灵芝发酵粉中三萜化合物的提取与测定

参照陈飞的方法，以齐墩果酸标准品，于555nm处测定吸光度，制得的标准曲线回归方程为y=57.516x-0.0114，R²=0.9993。

称取2g灵芝发酵粉，加入适量一定浓度的乙醇浸泡一段时间后，在一定温度下进行回流处理。回流后取出放冷，在20℃下以4000r/min离心10min，合并上清液。将上清液减压浓缩至5mL，用移液管吸取1mL到试管中，分别加入0.3mL5%香草醛-冰醋酸溶液和1mL高氯酸，70℃水浴25min，冷水浴中冷却，加入10mL冰乙酸，摇匀后测定。

在单因素试验的基础上，采用响应面BoxBehnken对灵芝发酵粉中三萜化合物提取工艺条件进行优化。响应面试验因素水平表见表1。

（2）灵芝三萜粗提物的分离纯化和结构鉴定

①灵芝三萜粗提物的分离纯化

将灵芝三萜粗提物经减压浓缩后进行硅胶柱层析分离纯化。第一次洗脱采用的洗脱剂为CHCl₃∶CH₃OH=90∶10，流速0.5mol/mL，每管2mL分部收集，薄层层析定性分析，选择展开呈现相同斑点流分收集，将分离的流分进行二次洗脱分离。二次洗脱的洗脱剂为CHCl₃∶CH₃OH=20∶1，流速0.5mol/mL，每管3mL分部收集，逐管测定三萜含量。

②灵芝三萜化合物的HPLC纯度鉴定

采用色谱柱：Agllent5TC-C18（2）250×4.6mm；柱温为室温；流动相为2%乙酸溶液-乙睛（70∶30）；流速1.0mL/min；进样量20µL；检测波长254nm。

③紫外光谱扫描

将灵芝酸溶于甲醇，以甲醇为空白试剂在190～370nm进行紫外光谱扫描。

④红外光谱分析

以KBr压片法进行红外光谱分析。

4、数据处理方法

所有试验重复3次，运用DPS软件进行方差显著性分析，Design-Expert软件对响应面试验数据进行二次模拟回归分析。

二、结果与分析

1、灵芝三萜的提取工艺优化

（1）乙醇浓度对灵芝发酵粉三萜得率的影响

由图1可知，采用不同浓度的乙醇对灵芝发酵粉中三萜化合物浸提得率有极显著影响（p＜0.01）。乙醇浓度为95%时，三萜得率最高。当乙醇浓度在95%以下时，三萜得率随乙醇浓度的提高而提高，但当乙醇浓度大于95%时，三萜的浸提得率反而会下降。因此，后续试验选择95%乙醇进行提取。

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