分子蒸馏纯化花生油甘油二酯及其成分变化研究（一）

甘油二酯（DAG）是分蒸分变指甘油中两个羟基与脂肪酸发生酯化反应得到的产物，是馏纯一种功能性油脂，它分为1,化花化研3-甘油二酯和1,2-甘油二酯两种异构体。研究表明其具有减少内脏脂肪的生油积累、控制体重、甘油降低血脂等功效。酯及甘油二酯可广泛应用于食品、其成药品、分蒸分变化妆品等。馏纯相对于化学法，化花化研酶法制备甘油二酯具有反应体系条件温和，生油产品纯度较高，甘油能耗低等优势。酯及以花生油为原料，其成生产花生油甘油二酯，分蒸分变不但风味独特，而且原料丰富，适于产业化生产。

目前报道分子蒸馏是分离甘油酯的最有效的技术，该技术主要有蒸馏温度低、工作真空度高、物料受热时间短以及分离效果好等优点，适用于高沸点、热敏性及易氧化物料的分离。近几年，油脂中的缩水甘油酯和反式脂肪酸受到国内外研究者的关注。缩水甘油酯对人体具有致癌性，过去日本花王公司生产了“Econa健康烹调油”，但随后检测机构在其中检测出缩水甘油酯含量超标，致使该产品不能在市场上销售。研究表明缩水甘油酯形成的过程与其前体物质有关，并将前体物质归结为单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯和氯。油脂在精炼脱臭过程中，高温处理会使反式脂肪酸含量增加。油脂中还存在维生素E、植物甾醇等有益成分，在合成及纯化过程中会有一定的损失。目前未有对分子蒸馏后花生油甘油二酯有益与有害成分的研究。本试验通过分子蒸馏纯化花生油甘油二酯，研究合成与纯化前、后的甘油酯组成、脂肪酸组成、缩水甘油酯（GEs）及营养物质的变化。这对加强控制油脂开发类食品的质量安全，以及油脂行业的发展和人们的身体健康具有重要的科学研究意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

鲁花一级花生油，南昌天虹超市；脂肪酸标品（GLC463标样），NuChek.Prep公司；丙三醇、无水硫酸钠、冰乙酸、氯化钠等均为分析纯级试剂；正己烷、甲醇、叔丁基甲醚、异丙醇、苯硼酸等为色谱纯级试剂。Novozym435脂肪酶，诺维信（中国）生物技术有限公司；3-氯-1,2-丙二酵（3-MCPD-d₅），加拿大TorontoResearchChemicals公司。

1.2仪器与设备

FA2204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；UIC-KDL1分子蒸馏，德国UIC公司；DSY-VI型氮吹仪，北京金科精华苑科技有限公司；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌锅，郑州市亚荣仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；6890N型气相色谱仪，美国Agilent公司；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司等。

1.3试验方法

1.3.1酶解法生产甘油二酯

利用Novozym435脂肪酶在无溶剂体系下通过甘油解反应制备甘油二酯，合成条件为：花生油与甘油物质的量比1∶2，加酶量6%，反应时间12h，反应温度70℃。反应结束后将反应体系进行离心，分离反应体系中的脂肪酶后，合成产物低温储存。

1.3.2分子蒸馏工艺研究

采取两级分子蒸馏从合成产物混合物中分离和纯化甘油二酯。首先，进行一级分子蒸馏将产物体系中的脂肪酸、甘油一酯在较低温度下与酰基甘油混合物分离，一级分子蒸馏条件：蒸馏温度180℃和200℃，冷凝温度20℃，转速200r/min，真空度0.1Pa，进料速率2mL/min，然后通过二级分子蒸馏在200℃温度以上从甘油三酯中分离出甘油二酯，考察二级分子蒸馏温度对甘油二酯纯度和得率的影响。

1.3.3甘油酯纯度测定

采用正相高效液相色谱法测定。测定条件：检测器：蒸发光散射检测器（Model300S，美国Softa公司）；色谱柱：HypersilBDSCPS(5μm,250mm×4.6mm，美国Thermo公司）；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；样品质量浓度：0.2mg/mL正己烷；流动相：正己烷（溶有0.4%的乙酸）和叔丁基甲醚（溶有0.4%乙酸）。采用梯度洗脱，洗脱程序：0～5min,100%正己烷；5～15min,100%～20%正己烷；15～17min,20%正己烷；17～17.1min,20%～100%正己烷；17.1～20min,100%正己烷。某种甘油酯的含量表示为该种甘油酯的峰面积占总的甘油酯峰面积的百分比。

甘油二酯的纯度定义为

式中，MAG（%）———产物中甘油一酯含量；DAG（%）———产物中甘油二酯含量；TAG（%）———产物中甘油三酯含量；FFA（%）———产物中游离脂肪酸的含量。

1.3.4理化性质测定

酸价采用GB5009.229-2016测定；过氧化值采用GB5009.227-2016测定；色泽采用GB/T22460-2008动植物油脂罗维朋色泽的测定。

1.3.5甘油三酯总脂肪酸组成分析

甘油三酯的脂肪酸组成参照本试验碱法甲基化方法：取2mg甘油三酯，溶于1.5mL正己烷，加入40μL乙酸甲酯和100μL(0.5mol/L）甲醇钠溶液，涡流混匀1min,37℃下反应20min后，置于冰箱下层-20℃冷冻10min，取出后立即加入60μL草酸溶液，离心弃去沉淀，N₂吹干，GC分析甘油三酯脂肪酸组成。

1.3.6气相色谱分析

色谱条件参照Cruz-Hernandez，色谱柱为CP-Sil88熔融石英毛细管柱（100m×0.25mm×0.2μm）。载气为H₂，燃烧气为H₂、N₂和空气。FID温度250℃，进样口温度250℃。气相色谱程序升温的时间为86min:45℃保持4min，以13℃/min的升温速率将温度升至175℃，保持27min后再以4℃/min的升温速率升至215℃，保持35min。脂肪酸的分析参照标准图谱，脂肪酸的百分含量采用面积归一化法确定（以峰值面积的百分比表示）。

1.3.7缩水甘油酯的测定

样品处理：称取2份油样0.1g于100μL甲基叔丁基醚中，再向油样中加入1μg3-MCPD-d5，分别标记为A,B，涡旋振荡两支试管至油样完全溶解。再向溶液中加入25g/L甲醇钠的甲醇溶液200μL，涡旋1min。酯交换反应的时间要控制在3.5～5.5min内，不断涡旋直至反应液澄清，试管A中加入600μL酸化的氯化钠溶液（200g/L），试管B中加入600μL酸化的溴化钠溶液（600g/L）终止酯交换反应。充分反应后，两支试管中再分别加入600μL的正己烷溶液，盖上盖子充分涡旋后离心5min(4000r/min），待反应液分层后去除有机层。此步骤重复3次。衍生反应：对于A,B试管，分别用600μL乙醚/乙酸乙酯混合溶剂（3∶2）反萃取其水相，充分涡旋后离心5min(4000r/min），待溶液分层后把有机相合并在装有少量无水硫酸钠的2mL离心管中，此步骤重复3次。再分别向有机相中加入200μL衍生化试剂（PBA溶于乙醚中饱和），充分涡旋后在30℃下反应20min。纯化复溶：衍生化反应结束后，用小气流氮气吹干，氮吹温度为45℃。氮吹完后，加入500μL异辛烷复溶，充分涡旋后离心1min(6000r/min），取200μL上层清液转移至GC瓶中，供GC-MS分析。气相色谱测定条件：不分流进样，进样体积1μL，载气为He,1.2mL/min恒速流动；升温程序为60℃，以6℃/min上升至130℃，保持8min，再以20℃/min上升至250℃并保持5min。质谱条件：EI+,SIM模式；EI离子源温度230℃，EI电离能量70eV；接口温度280℃；溶剂延迟6min；选择3-MCPD-d5m/z为201,150;3-MCPDm/z为196,147定性定量。

1.3.8甾醇的测定

精确称取0.05～0.1g（精确至0.1mg）的样品置于带盖的试管中，加入5.0mL2mol/L氢氧化钾的乙醇溶液后加盖密封，剧烈振摇30s，置于60℃水浴中皂化1h，并保持振摇，用水冷却至室温后加入1.0mL二次水和4.0mL正己烷，密封后剧烈振摇，静置，将上层（正己烷层）转移至另一试管中，用N2吹干正己烷后加入1mL甲醇溶解，用0.45μm微孔滤膜滤过并转至进样瓶中，在试验设定条件下进行HPLC测定。液相色谱分析条件参见江海、冯妹元等和牟德华等的方法，并在此基础上作少许改动，采用二极管阵列检测器（DAD），条件如下：色谱柱：HypersilODS2-C18(5μm,4.6mm150mm）流动相：纯甲醇。流速：1.0mL/min。检测波长：210nm。柱温：30℃。进样量：10L。分析时长：20min。

1.3.9维生素E的测定

称取一定量VE标品，记录下质量，用正己烷定容。再从其中依次分别精确移取0.5,1,2,3,4,6mL，稀释至10mL。采用HPLC分析，每个样品平行测3次，绘制标准曲线。样品预处理：准确称取1g菜籽油于10mL棕色容量瓶中，正己烷定容。经0.45μm有机膜过滤后进样。

色谱柱：依利特HypersilODS2(5μm,4.6mm×150mm），流动相为甲醇：水（体积比98∶2），进样5μL，流速设置为0.8mL/min，紫外检测波长：λex=295nm，柱温：25℃。

1.4统计方法

用SPSS20.0对数据进行分析以及图表绘制，检测结果用Mean±SD表示；所有试验均重复3次以上，并且用单因素方差分析比较均值，P<0.05为显著性差异。

2结果与分析

2.1合成及分子蒸馏前、后甘油酯组成液相色谱图

图1分别为混合甘油酯标准品、合成甘油酯及分子蒸馏一次和二次的液相图谱，横坐标为时间，纵坐标为响应信号，出峰顺序依次为FFA、TAG、1,3-DAG、1,2-DAG和MAG，分离效果很好。分子蒸馏一次后可除去游离脂肪酸和甘油一酯。分子蒸馏二次后可只保留甘油二酯组分。

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