响应面法优化超声辅助提取桦剥管菌多糖及其抗氧化活性研究（一）

桦剥管菌隶属于真菌门、响应性研担子菌亚门、面法层菌纲、优化非褶菌目、超声多孔菌科、辅助剥管菌属，桦剥化活又称为桦多孔菌、管菌桦滴孔菌或桦孔菌，多糖是及其究桦木属树木专有性木腐菌。其形态特征：子实体中大型(最大直径可达30cm)，抗氧无柄或几乎无柄，响应性研上部为扁半球形，面法下部为扁平形，优化生长初期为污白褐色，超声后期为褐色。辅助表面有一层褐色的薄薄的表皮，撕去后可露出白色的菌肉，边缘内卷(图1，照片由延边华夏桑黄菌业有限公司提供)。菌肉很厚实，近肉质且口感滑嫩，经过晾晒脱水后，菌肉会成为较轻的革质状。桦剥管菌分布地区广泛，陕西、福建、安徽、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、四川、云南、贵州、新疆、西藏、河南、湖南等地区。

桦剥管菌既是能够高效地降解木质纤维素的褐腐菌，也是一种实用真菌与药用真菌。桦剥管菌多糖是桦剥管菌的主要活性成分之一，具有消炎、抑菌的功能，同时，桦剥管菌多糖具有“二抗作用”，即抗病毒和抗癌作用。目前，国内外对桦剥管菌的降解木材能力以及提取物的研究较多，而有关研究和应用桦剥管菌多糖的报道较少，桦剥管菌为一年生真菌，产量高且在我国储量丰富，本研究以桦剥管菌子实体干品为实验材料，采用响应面法优化桦剥管菌多糖超声辅助提取工艺，通过单因素实验和Box-Behnken(BBS)实验，确定桦剥管菌多糖最佳提取工艺条件，并对其进行抗氧化活性研究，以期为桦剥管菌的开发、研究与利用提供科学的理论依据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

桦剥管菌子实体干品，2017年11月购于延边华夏桑黄菌业有限公司。

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、硫酸亚铁、水杨酸、H202、抗坏血酸(VC)、1-1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、95％乙醇，以上试剂均为分子纯。

2、仪器与设备

实验所用仪器、设备如表1所示。

3、方法

（1）桦剥管菌多糖的提取工艺流程

桦剥管茵子实体干品→烘干至恒质量→桦剥管茵粉→取19桦剥管茵粉加水调配液料比→水浴提取→超声波处理→离心→稀释100倍→苯酚→硫酸法显色→490nm测定吸光值。

（2）葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃、4h烘干至恒重的葡萄糖50mg定容于500mL容量瓶中，配成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别精密移取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、lmL于大试管中，补加蒸馏水至1.0mL。分别精密移取上述葡萄糖溶液1mL，分别加6％苯酚溶液0.5mL，浓硫酸2.5mL，震荡摇匀，室温放置10min后于490nm测定吸光值。

（3）桦剥管菌多糖含量及得率的测定

采用苯酚-硫酸法进行桦剥管菌多糖含量的测定。准确吸取样品溶液lmL于试管中，分别加6％苯酚溶液0.5mL，浓硫酸2.5mL，震荡摇匀，室温放置10min后于490nm测定吸光值。根据测得的吸光值带入标准曲线回归方程，计算得桦剥管菌多糖浓度。再将多糖浓度带入以下公式，计算桦剥管菌多糖得率：

桦剥管菌子实体多糖得率(％)=C×V×n/m×100％，其中，C是测得吸光度对应的浓度；V是提取液总体积；n是稀释的倍数；m是桦剥管菌子实体粉末质量。

（4）桦剥管菌多糖提取单因素实验

按工艺流程方法提取桦剥管菌多糖，选择水浴温度、超声温度、超声时间、超声功率、液料比进行单因素实验，以桦剥管菌多糖得率为研究指标，考察各个因素对桦剥管菌多糖得率的影响。不同因素梯度条件见表2。

（5）超声波辅提桦剥管菌多糖工艺的Box-Behnken响应面实验设计

基于单因素实验结果，选择水浴温度(A)、超声功率(B)、料液比(C)为自变量，桦剥管菌多糖得率(Y)为响应值，应用Design—Expert.V8.0.6软件的Box-Behnken(BBD)实验原理设计3因素3水平响应面实验，对超声波辅提桦剥管菌多糖的工艺条件进行优化。实验因素及水平设计表，见表3。

（6）羟基自由基清除力测定

根据H₂O₂与Fe²⁺作用产生羟基自由基，并使水杨酸显色的方法测定羟基自由基清除能力。参照林琳的实验方法并做适当修改。分别精确配制0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8mg/mL样品多糖溶液，依次在试管中加入1.0mL的FeSO。溶液(9mmol/L)，1.0mL的不同浓度的桦剥管菌多糖溶液，1.0mL的H202溶液(0.03％)和1.0mL的水杨酸溶液(9mmol/L)。将反应液置于37℃水浴30min，在510nm处测定各反应液的吸光值。空白组的多糖溶液由蒸馏水代替。对照组用同等浓度的VC溶液代替多糖溶液。按照下式计算羟基自由基的清除率。

羟基自由基清除率(％)=(Ao-A)/Ao×100％，其中，Ao：空白组的吸光值；A：样品组的吸光值。

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相关链接：二苯基-2-苦肼基，硫酸亚铁，水杨酸，苯酚