现代食品检测技术之分子生物学技术（一）

分子生物学是现代学技从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科。它以核酸和蛋白质等生物大分子的食品生物术结构、组成和功能，检测技术以及它们在遗传信息和细胞信息传递中的现代学技作用等为研究对象，是食品生物术当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域。

目前分子生物学技术广泛地应用于生物科学的检测技术各个领域，近些年来，现代学技核酸分子生物学技术，食品生物术特别是检测技术核酸分子杂交和PCR技术在食品安全检测方面也得到了很好的应用。

二、现代学技PCR技术

聚合酶链反应(PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。食品生物术PCR技术具有特异性强、检测技术灵敏度高、现代学技操作简便、食品生物术快速、检测技术对标本的纯度要求低、无放射性污染等特点，因而此方法在疾病诊断、法医判定、考古研究、食源性病原菌和食品转基因成分的检测等方面也得到了广泛的应用并显示出巨大的发展前景。

(一)PCR的原理

和天然DNA的复制过程一样，PCR的DNA体外酶促扩增包括变性、退火和延伸三个基本的过程，它们之间通过温度的改变来实现相互转换。所谓变性是指模板DNA在95℃左右的高温下，双链DNA解链成单链DNA，并游离于溶液中的过程；退火是指人工合成的一对引物在适合的温度下(通常是50～65⁰C)分别与模板DNA需要扩增区域的两翼进行准确配对结合的过程；引物与模板DNA结合后，在适当的条件下(温度一般为70～75⁰C)，以四种dNTP为材料，通过DNA聚合酶的作用，单核苷酸从引物的3’末端掺入，沿模板合成新股DNA链，这就是所谓的延伸。经反复循环，使靶DNA片段呈指数增加。PCR的基本过程如图3-22所示。

(二)PCR的操作过程

不同PCR的原理和操作过程基本相同，但是不同的PCR,其具体的操作过程和反应溶液的组成稍有差异，在此仅就标准PCR的反应过程和操作要点进行叙述。

1、反应体系

标准PCR的反应体积为20～100μL，其中含有1×PCR缓冲溶液[50mmol/L KCl、10mmol/L Tris—HCI(pH 8.3)、2mmol/LMgCl₂、lOOμg／mL明胶]、四种dNTP各20μmol/L、一对引物各O.25μmol/L、DNA模板0.1μg左右(根据具体情况加以调整，一般需要10²～10⁵拷贝的DNA)和2U的Taq DNA聚合酶。

2、反应步骤

在O.5mL的小离心管中依次加入PCR的反应缓冲液、四种dNTP、引物、DNA模板，混匀，95℃加热10min，以除去样品中蛋白酶、氯仿等对Taq DNA聚合酶的影响，然后，每管加入2U的Taq DNA聚合酶，混匀，离心30s，加50μL液体石蜡封盖反应体系，以防止反应液挥发(现在有些PRC由于具有很好的密封性，也可以不加液体石蜡)，同时根据实验要求设计PCR仪的各种循环参数，将离心管置于PCR仪中进行PCR循环。

3、PCR扩增产物的检测

PCR扩增结束后，根据实验目的的不同，可以采用多种方法对扩增产物进行分析，下面介绍其中较为常用的几种方法。

(1)凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB(溴化乙锭)染色，紫外灯下观察，初步判断产物的特异性，包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

①琼脂糖凝胶电泳：根据扩增片段的大小，采用适当浓度的琼脂糖制成凝胶，取PCR的扩增产物5～10μL点样于凝胶中，电泳，EB染色，紫外灯下观察，成功的PCR扩增可得到分子量均一的一条区带，对照标准分子量谱带对PCR产物谱带进行分析。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：6％～10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

(2)分子杂交：包括斑点杂交、Southern印迹杂交和微孔板夹心杂交等。在这些杂交中，通过分析PCR的扩增产物与相应探针结合后的杂交体，从而判断出PCR产物是否是预先设计的目的片段，还能鉴定出产物中是否存在突变，以及扩增产物的大小和特异性等。有关这些杂交的具体操作过程，请参阅相关文献。

(3)核酸序列分析：分析PCR产物的序列，是检测PCR产物特异性最可靠的方法。

(4)颜色互补分析法：颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段(例如在多重PCR中A和B两个片段)同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记(A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明)。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色(红色或绿色)；如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带；如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色的黄色带；如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除去未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色，此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补色的黄色带。

该法简便、易于自动化，可用于检测基因缺失、染色体转位和病原微生物，例如采用多重PCR，结合颜色互补分析法，通过观察PCR产物的颜色，可以同时快速检测多种病原菌，是当今食品安全快速检测的发展方向之一。

(三)PCR的类型

PCR技术自诞生以来，发展迅速，应用面广。因实验材料、实验目的和实验要求等的不同，在标准PCR的基础上，已衍生出近几十种不同类型的PCR，主要有不对称PCR、多重PCR、反向PCR、标记PCR、定量PCR等，这些PCR和标准PCR的原理相同，但是由于实验目的的不同，各自的具体操作过程稍有不同，此处不再逐一介绍。

三、生物芯片技术

生物芯片也称为微阵列，它利用微电子、微机械、化学和物理技术、计算机技术，使样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。因此，生物芯片具有多元化、高通量、检测时间短、样品用量少和便于携带等诸多优点。

生物芯片技术主要包括四个基本要点：芯片阵列的构建、样品的制备及标记、生物分子反应、信号检测和数据处理。

①芯片阵列的构建：将DNA片段或蛋白质等生物分子按设计好的顺序排列在表面处理过的载体上。

②样品的制备及标记：生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，因此要对样品进行生物处理，以获取其中所需的蛋白质或核酸等分子，并对其进行标记，作为后续反应的检测信号。

③生物分子反应：芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间的反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比例。

④信号检测和数据处理：常用的检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息，然后利用计算机软件对所得数据进行分析处理。

生物芯片类型可以从不同的角度来划分。当前人们常常提到的基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室，就是从芯片的检测对象和使用目的来区分的。此外，还有组织芯片、细胞芯片等具有不同检测目的的芯片。

参考资料：食品检测技术